Коллекция «Живопись» насчитывает более 870 произведений. В большинстве своём это работы, связанные с Таганрогом, его историей и культурой, с жизнью и творчеством А.П. Чехова. Особое место занимают в коллекции работы членов семьи Чеховых – брата писателя Николая Чехова, его сестры Марии Павловны, племянника писателя С.М. Чехова и его сына С.С. Чехова.

Гордостью коллекции живописи является картина В.Д. Поленова «Пруд с вётлами», вывезенная нацистами в период оккупации Таганрога и вернувшаяся в собрание музея в 2017 году.

В коллекции «Иконопись» – около 240 единиц хранения (иконы различных школ Средней России, греческие и армянские XIX – начала ХХ веков). По своей сюжетной направленности коллекция отражает основные каноны христианской иконописи.

Особый интерес представляют иконы, имеющие индивидуальную историю. Среди них икона «Божья Матерь Ченстоховская» из Успенского собора Таганрога, разрушенного в годы советской власти, «Положение во гроб» – икона, спасённая солдатом российской армии из разрушенного дома в Чечне.